CRISPR/Cas9是一種快速有效的基因編輯工具，但是它在識別DNA時需要目標序列下遊有一個特定的序列，稱為PAM。PAM越短，在基因中分布就越多，Cas9能編輯的位點就越多。因此，開發識別短PAM的Cas9是研究熱點。SaCas9是小型Cas9，能夠被單個AAV病毒載體包裝遞送用於體內基因治療。SaCas9識別的PAM是NNGRRT，受到4個堿基的限製，在基因組中分布較少。有研究人員將SaCas9識別的PAM改造成了NNNRRT，但是依然受到3個堿基的限製。王永明課題組先前鑒定了16個SaCas9同係物的PAM序列，其中SauriCas9和SlugCas9識別NNGG PAM，隻受到2個堿基的限製。
2022年11月，王永明課題組又有新突破，聯合東南大學柴人傑團隊和蘇州大學胡士軍團隊在PLOS biology上發表了題為“Identification of SaCas9 orthologs containing a conserved serine residue that determines simple NNGG PAM recognition”的研究論文。該研究分析了Cas9序列和PAM的對應關係，發現識別NNGG PAM的Cas9存在3個保守的氨基酸。如果將其中兩個氨基酸替換到SaCas9上麵，就能使SaCas9識別NNGG PAM（圖1）。
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圖1. （A）17個SaCas9同係物PI結構域的氨基酸序列。SauriCas9和SlugCas9特有的3個氨基酸用紅色標記出來。（B）將SaCas9的2個或者3個氨基酸替換後識別NNGG PAM。
此外，該研究又在數據庫中找到了5個含有保守氨基酸的Cas9，實驗證實它們都識別NNGG PAM（圖2）。
圖2. （A）5個新的SaCas9同係物PI結構域的氨基酸序列。特有的氨基酸用紅色標記出來。（B）5個SaCas9同係物的PAM序列。
Sha2Cas9和SpeCas9具有很高的編輯活性，但是存在脫靶現象。將Cas9和DNA之間形成非特異性氫鍵的氨基酸替換後，得到了精準版本的Cas9，極大的減少了脫靶（圖3）。Sha2Cas9、SpeCas9和先前開發的SlugCas9都具有姘美SpCas9活性的優點。此外，還具有基因小、編輯範圍大、不容易脫靶等優點，是基因編輯的理想工具。
王永明課題組致力於開發小型CRISPR-Cas9工具，建立了高效的篩選平台，先後開發出SauriCas9（NNGG PAM，PLoS Biol 2020）、SlugCas9（NNGG PAM，Nucleic Acids Res 2021）、SchCas9（NNGR PAM，Adv Sci 2022）、NarCas9（NNNNC PAM，eLife 2022）等，不斷擴大編輯範圍，提高編輯性能。
圖3.（A）GFP報告基因分析脫靶。（B）GUIDE-seq全基因組分析脫靶。
万博英超狼队网官方网 碩士生王帥和生陶晨是論文的共同第一作者，狗万外围充值 王永明教授，東南大學柴人傑教授和蘇州大學胡士軍教授是論文的共同通訊作者。
原文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001897