王永明和蘭峰課題組聯合開發出特異性極高的CRISPR/Cas12j工具

王永明和蘭峰課題組聯合開發出特異性極高的CRISPR/Cas12j工具

RNA引導的CRISPR-Cas係統被廣泛用於哺乳動物細胞的基因編輯，在遺傳病的基因治療中展現出巨大的應用潛力。作為基因治療工具，特異性是一個非常關鍵的指標。如果一個CRISPR-Cas係統特異性不高，就會發生脫靶。脫靶是人們最擔心的問題，它可能會破壞正常基因，引發癌症。另外，很多顯性基因突變是單堿基突變，如果能選擇性的敲除突變等位基因，隻保留正常等位基因，就能達到治療效果。這就要求CRISPR-Cas係統有極高的特異性。到目前為止，II類的Cas9和V類的Cas12被廣泛開發為基因編輯工具。SpCas9是第一個開發出來的Cas9，也是應用最廣泛的Cas9，但是脫靶嚴重。隨後科研人員通過改造SpCas9或者開發新的CRISPR-Cas係統來提高特異性，但是區分單堿基突變依然是一個挑戰。

狗万外围充值 王永明課題組致力於係統的開發CRISPR/Cas工具，滿足不同場景的應用。王永明課題組建立了鑒定Cas活性的新思路，將基因編輯和GFP表達偶聯，實現了在哺乳動物細胞中對CRISPR/Cas係統的快速篩選。團隊先後對300多個Cas9進行鑒定，開發出一係列性能優異的小型Cas工具酶，可被單個AAV包裝遞送，是基因治療的理想工具。該課題組於2020年3月開發出的SauriCas9，識別NNGG PAM（PLoS Biol）；2021年4月開發出SlugCas9-HF，特異性大幅提高（NAR），而編輯活性和SpCas9相當；2021年12月開發出SchCas9，識別更簡單的NNGR PAM（Adv Sci）；2022年8月開發出Nsp2Cas9及其嵌合體核酸酶，分別識別N₄CC和N₄C PAM（eLife）；2022年11月開發出Sha2Cas9-HF和SpeCas9-HF，識別NNGG PAM，特異性和活性都很高（PLoS Biol）；2023年2月開發出Hsp1-Hsp2Cas9-Y，識別N4CY PAM（Mol Ther）。這些研究不斷擴大編輯範圍，提高編輯活性和特異性。

2023年2月10日，王永明課題組聯合阜外醫院蘭峰課題組開發出特異極高的Cas12j-8工具，能夠區分單堿基突變，論文發表在Science Advances上，題為“A highly specific CRISPR-Cas12j nuclease enables allele-specific genome editing”。

Cas12j是最近發現的一類CRISPR-Cas係統，基因很小，隻包含crRNA和Cas12j兩個元件，不需要tracrRNA。作者在哺乳動物細胞中對6個Cas12j蛋白進行篩選，發現Cas12j-8和Cas12j-10具有編輯活性。它們識別TTN PAM，編輯範圍較大（圖1）。  

圖1. Cas12j-8識別TTN PAM，編輯範圍大。

作者隨後比較了Cas12j-8、SpCas9、AsCas12a的編輯活性。在11個測試位點中，Cas12j-8編輯活性比SpCas9略低，比AsCas12a高(圖2)。

作者又分析了Cas12j-8的特異性。利用GFP激活表達係統測試特異性。GFP含有一個插入片段，造成移碼突變。對插入片段進行編輯，產生indel，會在一部分細胞中產生整碼突變，GFP得以表達。設計一係列含有單堿基的crRNA靶向GFP，發現Cas12j-8特異性極高，在sgRNA1-14位不能容忍單堿基錯配(圖3A)。利用全基因組脫靶分析技術（GUIDE-seq）分析3個crRNA的脫靶情況，未發現脫靶(圖3B)，說明該Cas12j-8特異性極高。FnCas9作為對照，在一個位點檢測到了兩個脫靶位點。

Cas12j-8隻有716 個氨基酸，蛋白很小。作者將Cas12j-8與腺嘌呤脫氨酶融合，開發出較小的Cas12j-8ABE8e堿基編輯器。對一係列位點進行編輯，在4個位點檢測到了A到G的堿基轉換，效率為5.1%-11.3%（圖4）。目前基於Cas9構建的堿基編輯器太大，無法用單個AAV包裝遞送。AAV是基因治療中最常用的遞送載體。Cas12j-8ABE8e含有938個氨基酸，在AAV包裝遞送範圍內，具有用於體內基因治療的潛力。

鑒於Cas12j-8蛋白具有較高的特異性，作者將Cas12j-8應用於單核苷酸多態性（SNP）位點的靶向編輯。Cas12j-8能夠很好的區分單堿基差異（圖5A-B）。針對Clin Var database 和dbSNP 數據庫中的SNP位點進行crRNA設計（圖5C），crRNAs位點數據已開放 (http://www.deephf.com/#/resources/snp-edit)。總之，Cas12j-8具有蛋白小、活性高、能區分單堿基突變的優點，具有廣泛的應用前景。

王瑤博士生是論文第一作者，万博英超狼队网官方网 王永明教授和中國醫學科學院阜外醫院蘭峰教授是論文的共同通訊作者。狗万外围充值 李明清、盧大儒、楊力、上海交通大學的張家毓、中山大學的高嵩教授給予大力支持。

論文DOI: 10.1126/sciadv.abo6405